تقنيات حفظ الانسجة بالتجميد

الحفظ بالتبريد هو حفظ الخلايا والأنسجة بالتجمد. الحفظ بالتبريد يعتمد على قدرة جزيئات صغيرة لدخول الخلايا ومنع الجفاف وتشكل بلورات الثلج داخل الخلايا، الذي يمكن أن يسبب موت الخلايا وتدمير العضيات الخلوية خلال عملية التجمد. هناك عاملين شائعين للحماية بالتبريد وهما ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) والغليسرول.

كيف يتم الحفظ بالتجميد

يستخدم الجليسرول بشكل أساسي لتبريد الخلايا الحمراء ويستخدم ثنائي ميثيل سلفوكسيد لحماية الخلايا والأنسجة الأخرى. هناك سكر يسمى ترهالوز، يوجد في الكائنات الحية التي تستطيع البقاء في ظروف جفاف شديدة ويستخدم في طرق التجميد للحفاظ على التبريد. ترهالوز يحافظ على توازن الأغشية الخلوية، وهو مفيد للحفاظ على الحيوانات المنوية والخلايا الجذعية وخلايا الدم.

تعتمد معظم أنظمة التبريد الخلوية على ثلاجة تحتوي على معدل يمكن التحكم فيه، وتستخدم أيضًا نظام التجميد الذي يوفر نيتروجين سائل في حجرة معلقة يتم فيها تعليق الخلية، ويساعد المراقبة الدقيقة لمستوى التجميد على منع جفاف الخلايا بسرعة وتشكيل بلورات الثلج.

عموما، يتم أخذ الخلايا من درجة حرارة الغرفة إلى درجة حرارة تبلغ -90 درجة مئوية (-130 درجة فهرنهايت) باستخدام ثلاجة تحكم في درجة الحرارة. يتم نقل الخلية المجمدة إلى ثلاجة تحتوي على النيتروجين السائل في درجات حرارة شديدة البرودة، إما على شكل بخار أو سائل. تقنية الحفظ بالتبريد التي تعتمد على ثلاجة المجففة لا تتطلب استخدام النيتروجين السائل.

تطبيقات الحفظ بالتجميد

حفظ الخلايا الجذعية

تطبيق مهم من الحفظ بالتبريد هو تجميد وتخزين الخلايا الجذعية المشكلة للدم، التي تتواجد في نقي العظم والدم المحيطي. في إنقاذ النخاع العظمي الذاتي، الخلايا الجذعية المكونة للدم تجمع من نقي العظم للمريض قبل البدء بالمعالجة الكيميائية. بعد العلاج، خلايا المريض المحفوظة بالتبريد تذوب وتدخل في الجسم. هذه العملية ضرورية جدا، لأن الجرعة العالية من العلاج الكيميائي تكون سامة لنقي العظم.

تم تحسين القدرة على حفظ الخلايا الجذعية الموجودة في الدم، وهذا أدى إلى تحسن في نتائج علاج بعض الأورام اللمفاوية والأورام السرطانية الصلبة. في حالة مرضى اللوكيميا، تكون خلايا دمهم سرطانية ولا يمكن استخدامها لإنقاذ نقي العظم الذاتي.

نتيجة لذلك، يعتمد هؤلاء المرضى على استخدام الدم المحفوظ بالتبريد من حوالب الأطفال حديثي الولادة أو خلايا جذعية مجمدة مأخوذة من المتبرعين. منذ التسعينات في القرن الماضي، تم إدراك أن الخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الجنينية قادرة على التطور لتشكيل الأنسجة العضلية والعصبية والهيكلية والعظمية.

يتم الآن التركيز بشكل كبير على تطوير هذه الخلايا في أنظمة زراعة الأنسجة، بالإضافة إلى أن الحفظ بالتبريد لهذه الخلايا يمكن أن يكون علاجًا مستقبليًا للكثير من الأمراض، بما في ذلك أمراض الجهاز العصبي والعضلي وأمراض الكبد والقلب.

حفظ الأجنة البشرية

الحفظ بالتبريد أيضا يستخدم لتجميد وتخزين نطاف وأجنة الإنسان. هذه التقنية مهمة جدا لتجميد الأجنة الإضافية التي تم إنتاجها من الإخصاب في المختبر. يمكن أن يختار الزوجين استعمال الأجنة المحفوظة بالتبريد لحمول لاحقة او في حال فشل الإخصاب في المختبر بالأجنة الطبيعية. خلال عملية تحول الأجنة المجمدة، الأجنة يتم زرعها في رحم المرأة. نقل الأجنة المجمدة يترافق مع زيادة طفيفة ولكن مهمة في خطر سرطان الأطفال بين الأطفال الذين ولدوا من أجنة كهذه.

انخفاض حرارة الجسم العميق

هو نوع من الحفظ بالتبريد الذي يستعمل عند المرضى ولديه تطبيقات عدة. الاستخدام الواسع للتحريض لانخفاض الحرارة العميق هو في العمليات الجراحية المعقدة للقلب والاوعية الدموية. بعد أن يتم وضع المريض مجرى قلبي هوائي جانبي كامل من خلال جهاز قلبي رئوي، الدم يمر من خلال غرفة التبريد.

يمكن تحقيق التحكم في التبريد عند المريض عند درجات حرارة منخفضة جدا تصل إلى حوالي 10-14 درجة مئوية (50-57 درجة فهرنهايت). يتوقف جميع الأنشطة الدماغية ويتم توفير الحماية للأعضاء الحيوية عند تلك الحرارة. عند تحقيق هذا المستوى العالي من التبريد، يمكن أن يتوقف القلب والرئتين، ويمكن للجراح تصحيح تشوهات القلب والأوعية الدموية المعقدة جدا خلال توقف الدورة الدموية.

خلال هذه الوقت، لا يتم تدفق الدم في المريض. بعد انتهاء الجراحة، يتم رفع درجة حرارة الدم تدريجيا بنفس الآلة التي استعملت للتبريد. التدفئة بالتدريج للعودة إلى درجة حرارة الجسم الطبيعية ينتج عنها استئناف لوظائف المخ والأعضاء. مع ذلك انخفاض درجة الحرارة العميق بعيد كل البعد عن التجميد والحفظ بالتبريد على المدى الطويل.

أهمية الحفظ بالتجميد

يمكن للخلايا أن تعيش لفترات طويلة إذا تم تجميدها بشكل صحيح. بالإضافة إلى ذلك، يمكن الحفاظ على بعض أنواع الأنسجة، مثل الغدة الدرقية المتطابقة، والأوردة، وصمامات القلب، والأنسجة الأبهرية، عن طريق التبريد بنجاح. يتم استخدام التجميد أيضا لتخزين والحفاظ على قابلية البقاء لفترات طويلة للأجنة البشرية المبكرة، والبويضات، والحيوانات المنوية. ينجح عملية التجميد المستخدمة لهذه الأنسجة بشكل جيد، وعند وجود عوامل الحفظ بالتبريد، يمكن تخزين الأنسجة لفترات طويلة بدرجات حرارة تبلغ -14 درجة مئوية (6.8 درجة فهرنهايت).

أظهرت الأبحاث أن الحيوانات المجمدة بدون عوامل حفظ بالتبريد يمكنها إنتاج خلايا حية تحتوي على حمض نووي سليم (الدنا) عندما تذاب. على سبيل المثال، تم استخدام أنوية خلايا الدماغ من الفئران المخزنة عند درجة حرارة تصل إلى -20 درجة مئوية (-4 درجة فهرنهايت) لأكثر من 15 عاما لإنتاج الخلايا الجذعية الجنينية. تم استخدام هذه الخلايا بعد ذلك لإنتاج نسخ من الفئران.

إجراءات الحفظ بالتبريد

الحفظ بالتبريد هو استعمال درجات حرارة منخفضة للحفاظ على حياة الكائنات الحية والأنسجة لفترة طويلة من الوقت. اعتمادا على أنواع الخلايا بين أنواع الثدييات المختلفة، هناك تنوع كبير في الاستجابة للحفظ بالتبريد والنجاة عملية التجميد والإذابة. تقنية الحفظ بالتبريد يمكن أن تقسم إلى أنواع عدة وهي:

• التجميد البطيء
• يتم التحول إلى زجاج بواسطة التزجيج، والذي يشمل ترسيخ الوسط المائي للخلية أو الأنسجة في مرحلة زجاجية غير بلورية
• التخزين غير المتجمد تحت الصفر
• الحفاظ على النسج في بيئة جافة.

بشكل عام، الحفاظ على الخلايا فيالثدييات في البيئة الجافة يواجه صعوبات بسبب التحديات في توفير سكر الترهالوز والأحماض الأمينية (التي تستخدم كمواد حافظة في النباتات) في الوسط داخل الخلية.

خطوات الحفظ بالتجميد

• يتم مزج عوامل التبريد مع الخلايا والأنسجة قبل التبريد
• يتم تبريد الخلايا أو الأنسجة عن طريق تخزينها في درجات حرارة منخفضة
• تدفئة الخلايا والأنسجة
• إزالة عوامل التبريد من الخلايا أو الأنسجة بعد الذوبان.
• الاستخدام السليم لعوامل التبريد يعد أمرًا مهمًا لتحسين قابلية الحياة للعينة التي تم حفظها بالتبريد.

سلبيات الحفظ بالتجميد

الآلية الدقيقة للأذى بسبب البرد والذي هو أذى الخلايا المترافق مع التغيرات المرحلية من الماء في كلا البيئات داخل الخلوية وخارجها في درجات الحرارة المنخفضة لم يثبت بشكل واضح. سرعات التبريد والإذابة يمكن ان تؤثر على التفاعلات الفيزيائية الحيوية والكيمياء الفيزيائية، وهذا يؤثر على معدل النجاة. الآلية الأذى بالبرد تتضمن تزق تناضحي ناجم عن المواد المذابة المركزة داخل الخلايا وتشكيل بلورات الثلج داخل الخلايا.

تتعلق هذه العمليات بدرجة التبريد، ويتم وصف حدود القابلية للحياة عند الخلايا بشكل أساسي بظروف الغشاء البلازمي السليم الذي يتميز بخصائص غير عادية. وفي النهاية، الظروف التي تسمح للغشاء البلازمي بالبقاء على قيد الحياة قد لا تسمح للكائنات الحية الداخلية في الخلية بالبقاء على قيد الحياة.